光學(xué)顯微鏡的相差觀察方法（Phase Contrast）是一種利用光的干涉原理來增強樣品與背景之間對比度的觀察技術(shù)。以下是對光學(xué)顯微鏡相差法觀察方法的詳細(xì)介紹：

一、成像原理

人眼只能在光波的波長（顏色）和振幅（亮度）有變化的情況下區(qū)分被檢物體。對于和周圍介質(zhì)折射率相差不大的透明狀物體，如活細(xì)胞、微生物等，光線通過時波長和振幅變化不顯著，難以分辨。相差觀察方法利用樣品的厚度和折射率引起的相位差，通過光學(xué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換，將這個相位差轉(zhuǎn)換成振幅差（即亮度差），從而提高樣品的可見度和對比度。

具體來說，當(dāng)光線通過樣品時，由于樣品不同部分的折射率不同，光線會發(fā)生不同程度的折射和相位延遲。這些相位差異在通過相差物鏡和相差聚光鏡時，會被轉(zhuǎn)換成振幅差異，使得樣品的不同部分在視野中呈現(xiàn)出不同的亮度，從而提高了樣品的清晰度和可見度。

二、關(guān)鍵部件

相差觀察方法需要以下關(guān)鍵部件：

相差聚光鏡：在光源與聚光鏡之間加入相差環(huán)（環(huán)形光闌），使透過聚光鏡的光線形成環(huán)形光。相差環(huán)的環(huán)狀孔直徑和孔寬與物鏡內(nèi)的相位環(huán)板匹配，形成的像恰好落在物鏡后焦面與相位板上的共軛面重合。因此，不同倍數(shù)物鏡要與不同倍數(shù)的環(huán)匹配。相差環(huán)可通過推拉環(huán)板、轉(zhuǎn)盤聚光鏡等形式切換進出光路。

相差物鏡：相差物鏡鏡片中裝有相位板，這個相位板通常由氟化鎂等材料制成，能夠?qū)⒅鄙涔饣蜓苌涔獾南辔煌七t1/4波長。根據(jù)相位板的不同設(shè)計，相差可以分為正相差和負(fù)相差兩種類型。正相差物鏡標(biāo)記為Ph，背景變暗，樣品邊界外圍形成白色光環(huán)；負(fù)相差物鏡標(biāo)記為Nh，背景非常暗，樣品邊界內(nèi)圍形成白色光環(huán)。

三、操作步驟

準(zhǔn)備樣品：將待觀察的樣品放置在載物臺上，并用壓片夾固定好。

對光：打開顯微鏡的電源開關(guān)，調(diào)節(jié)光源和聚光鏡，使光線形成環(huán)形光照明。

放置相差物鏡：將相差物鏡安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，并旋轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)。

調(diào)節(jié)焦距：使用粗調(diào)和細(xì)調(diào)螺旋調(diào)節(jié)焦距，使樣品在視野中清晰可見。

觀察：通過目鏡觀察樣品，并調(diào)整光源強度和光圈大小以獲得Z佳的觀察效果。

四、注意事項

選擇合適物鏡和聚光鏡：不同倍數(shù)的物鏡需要配合相應(yīng)倍數(shù)的相差聚光鏡使用，以確保獲得Z佳的相差效果。

保持樣品清潔：樣品表面B須清潔無塵，否則會影響觀察效果。

調(diào)節(jié)光源強度：光源強度應(yīng)適中，過強或過弱都會影響觀察效果。

對中調(diào)節(jié)：相差環(huán)附近通常有對中螺絲，用于對中相差環(huán)。未調(diào)中的相差環(huán)會導(dǎo)致相差效果大打折扣。對中望遠(yuǎn)鏡（合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡）可用于調(diào)中相襯環(huán)。

五、應(yīng)用

相差觀察方法在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，特別是在細(xì)胞生物學(xué)和微生物學(xué)研究中。相差顯微鏡能夠清晰地觀察到活細(xì)胞、微生物等無色透明樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，為科學(xué)研究提供了有力的支持。

綜上所述，光學(xué)顯微鏡的相差觀察方法是一種利用光的干涉原理來增強樣品與背景之間對比度的觀察技術(shù)。通過合理配置和使用相差聚光鏡和相差物鏡等關(guān)鍵部件，并遵循正確的操作步驟和注意事項，可以獲得高質(zhì)量的相差圖像。