來(lái)源：教育裝備采購(gòu)網(wǎng) 作者：MedChemExpress 責(zé)任編輯：張肖
在細(xì)胞的“花樣”死亡方式一文中，小 M 已經(jīng)介紹過(guò)細(xì)胞的死亡方式有十幾種，凋亡只是其中一種：細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)，又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。
與被動(dòng)的細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡是主動(dòng)發(fā)生的，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程，期間涉及一系列基因的靈活、表達(dá)以及調(diào)控等。
圖 1. 細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路[1]
細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞皺縮、凋亡小體的形成等。
圖 2. 細(xì)胞凋亡過(guò)程
細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
細(xì)胞凋亡，我們?cè)撊绾螜z測(cè)呢?目前至少有數(shù)十種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標(biāo)記三大類(lèi)。
■ 基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法
1.1 電子顯微鏡檢測(cè)
電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞皺縮、凋亡小體的形成等。
圖 3. BBR 和 DDP 誘導(dǎo)下 OVCAR3 細(xì)胞的凋亡形態(tài)[2]
1.2 細(xì)胞核染色檢測(cè)
細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，染色質(zhì)發(fā)生固縮，故經(jīng) DAPI、Hoechst系列等熒光染料染色后可快速檢測(cè)細(xì)胞凋亡。除了實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低廉之外，細(xì)胞核染色還可以定量。
圖 4. PC-3 細(xì)胞凋亡過(guò)程中核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化[3]
注：Hoechst 33342 染色觀察到核碎裂和核凝結(jié)。用 0、0.3、0.6、0.9 和 1.2 mg/mL 的莖提取物處理 PC-3 細(xì)胞 24h 后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化。照片在 20× 熒光顯微鏡下拍攝。箭頭表示凋亡細(xì)胞。
■ 基于生物學(xué)功能的方法
2.1 線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè)
凋亡早期細(xì)胞，線(xiàn)粒體膜通透性增加，線(xiàn)粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線(xiàn)粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中近早發(fā)生的生物學(xué)變化。一旦線(xiàn)粒體膜電位被破壞，細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。
目前常用一些親脂性陽(yáng)離子染料如 JC-1 (HY-K0601) 檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化。線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 在基質(zhì)中匯聚形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中，以單體形式存在產(chǎn)生綠色熒光 (Ex/Em=510/527 nm)。
圖 5. JC-1法檢測(cè) KRA-533刺激下不同細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位變化[4]
2.2 細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測(cè)
在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS) 位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；細(xì)胞凋亡早期，PS 會(huì)外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V (膜聯(lián)蛋白 V) 是一種 Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，可與 PS 特異性結(jié)合，因此 Annexin V 常作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。Annexin V 經(jīng) FITC 標(biāo)記后可發(fā)綠色熒光。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色液是一種不能穿透細(xì)胞膜的紅色熒光染料，可對(duì)凋亡晚期細(xì)胞及壞死細(xì)胞染色。
經(jīng) Annexin V-FITC 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細(xì)胞基本無(wú)熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。
圖 6. 不同濃度臭椿酮誘導(dǎo) A375 細(xì)胞的凋亡情況[5]
此外，除了用 FITC 標(biāo)記 Annexin V 之外，也可以用 EGFP、PE、mCherry 等作為熒光探針哦。
■ 基于生化標(biāo)記的方法
3.1 凋亡分子標(biāo)記檢測(cè)
Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) 蛋白家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有重要的作用。絕大多數(shù)情況下，所有的凋亡信號(hào)都會(huì)匯集到凋亡的執(zhí)行者 Caspase-3 上。在正常細(xì)胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被靈活，并執(zhí)行過(guò)后的凋亡程序。因此可以通過(guò)檢測(cè) Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來(lái)反應(yīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程。此外，也可以通過(guò)檢測(cè) Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
圖 7. ZnO-NPs 誘導(dǎo)牙齦癌細(xì)胞的凋亡情況[6]
3.2 DNA 片段化檢測(cè)
在細(xì)胞凋亡的后期，Caspase 會(huì)靈活 Caspase-Activated DNase (CAD)，切割核小體之間的 DNA，形成以 180-200 bp 為單位的 DNA 片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后形成 DNA ladder。
圖 8. DNA 片段化檢測(cè) MCP30 誘導(dǎo)下 Ishikawa H 細(xì)胞的凋亡情況[7]
注：泳道 1-4 分別表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 誘導(dǎo) 72h 的 Ishikawa H 細(xì)胞
3.3 DNA 片段原位檢測(cè) (TUNEL 法)
細(xì)胞凋亡時(shí)，相關(guān) DNA 內(nèi)切酶被靈活，進(jìn)而切斷核小體間的基因組 DNA，產(chǎn)生 180-200 bp 的 DNA ladder，暴露的 3’-OH 在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針標(biāo)記的 dUTP，借助熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
圖 9. TUNEL 法檢測(cè)苦參堿刺激下 HepG2 細(xì)胞凋亡情況[8]
看了這么多，相信大家對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法都有了大概的了解。
參考文獻(xiàn)
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